Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстратов, ферментов, температуры. Ферментативных реакций кинетика Кинетика ферментативных реакций кратко

§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:

где v – скорость ферментативной реакции, – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время.

Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции. Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента. Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.

В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:

Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.

Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.

Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (V max). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.

Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,

где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; K M – константа Михаэлиса.

Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ V max , получаем K M = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.

Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.

Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 о С) повышение температуры на каждые 10 о С в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции в 2 – 4 раза. При высоких температурах более 55 – 60 о С активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 о С. Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.

Влияние рН на скорость ферментативной реакции

График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.

Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции

График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.

Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:

a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,

b) ионизацию субстрата,

c) конформацию фермента и его активного центра.

Ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами . Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.

Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые . Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением активности фермента невозможна:

Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего. Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия. На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов - веществ, ядовитых для насекомых.

Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:

Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту. При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо. После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.). Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре, такое ингибирование называется конкурентным.

Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.

Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов. Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.

Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).

Рис. 35. Механизм действия неконкурентного ингибитора

В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN - . Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.

Аллостерические ферменты

Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36). С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами . Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента. Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.

Рис. 36. Структура аллостерического фермента.

Регуляция мультиферментных систем

Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:

В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.

ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КИНЕТИКА

изучает закономерности протекания во времени ферментативных р-ций, а также их механизм; раздел кинетики химической.

Каталитич. цикл конверсии в-ва S (субстрата) в продукт P под действием фермента E протекает с образованием промежут. соед. X i :

где ki - константы скорости отдельных элементарных стадий, образования фермент-субстратного комплекса X 1 (ES, комплекс Михаэлиса).

При данной т-ре скорость р-ции зависит от концентраций фермента, субстрата и состава среды. Различают стационарную, предстационарную и релаксационную кинетику ферментативных р-ций.

Стационарная кинетика. В стационарном состоянии по промежуточным соед. (dX i /dt = 0, i = 1, ..., n ) и при избытке субстрата , где [S] 0 и [E] 0 - начальные концентрации соотв. субстрата и фермента, кинетика процесса характеризуется постоянным, неизменным во времени уровнем концентраций промежут. соед., а выражение для скорости процесса v 0 , наз. начальной стационарной скоростью, имеет вид (ур-ние Михаэлиса- Ментен):

(1)

где значения k кат и К м -> ф-ции констант скорости элементарных стадий и заданы ур-нениями:

Величину k кат наз. эффективной каталитич. константой скорости процесса, параметр К м -> константой Михаэлиса. Значение k кат определяется величинами наиб. медленных стадий каталитич. р-ций и иногда наз. числом оборотов фермента (ферментной системы); k кат характеризует число каталитич. циклов, совершаемых ферментной системой в единицу времени. Наиб. распространены , имеющие значение k кат. для специфич. субстратов в диапазоне 10 2 -10 3 с -1 . Типичные значения константы Михаэлиса лежат в интервале 10 -3 - 10 -4 M.

При больших концентрациях субстрата, когда т. е. скорость р-ции не зависит от концентрации субстрата и достигает постоянной величины, наз. макс. скоростью. Графически ур-ние Михаэлиса - Ментен представляет собой гиперболу. Его можно линеаризовать, используя метод двойных обратных величин (метод Лайнуи-вера - Берка), т. е. строя зависимость 1/vот 1/[S] 0 , или др. методы. Линейная форма ур-ния (1) имеет вид:

(2)

Она позволяет определить графически значения К м и v макс (рис. 1).

Рис. 1. График линейной трансформации ур-ния Михаэлиса - Ментен в двойных обратных величинах (по Лайнуиверу - Берку).

Величина К м > численно равна концентрации субстрата, при к-рой скорость р-ции равна , поэтому К м часто служит мерой сродства субстрата и фермента, однако это справедливо лишь, если

Величины К м > и изменяются в зависимости от значений рН. Это связано со способностью участвующих в катализе групп молекулы фермента изменять свое состояние ионизации и, тем самым, свою каталитич. эффективность. В простейшем случае изменение рН приводит к протонированию или депротонированию, по крайней мере, двух ионизирующихся групп фермента, участвующих в катализе. Если при этом только одна форма фермент-субстратного комплекса (напр., ESH) из трех возможных (ES, ESH и ESH 2) способна превращаться в продукт р-ции, то зависимость скорости от рН описывается ф-лой:

где f = 1 + / и f " = 1 + + K" b /> -т. наз. рН-ф-ции Михаэлиса, а К а, К b и К" a , K" b -> константы ионизации групп аи bсоотв. своб. фермента и фермент-субстратного комплекса. В координатах lg - рН эта зависимость представлена на рис. 2, причем тангенсы углов наклона касательных к восходящей, независимой от рН, и нисходящей ветвям кривой должны быть равны соответственно +1, 0 и -1. Из такого графика можно определить значения рК а групп, участвующих в катализе.

Рис. 2. Зависимость каталитич. константы от рН в логарифмич. координатах.

Скорость ферментативной р-ции не всегда подчиняется ур-нию (1). Один из часто встречающихся случаев - участие в р-ции аллостерич. ферментов (см. Регуляторы ферментов), для к-рых зависимость степени насыщения фермента от [S] 0 имеет негиперболич. характер (рис. 3). Это явление обусловлено кооперативностью связывания субстрата, т. е. когда связывание субстрата на одном из участков макромолекулы фермента увеличивает (положит. кооперативность) или уменьшает (отрицат. кооперативность) сродство к субстрату др. участка.

Рис. З Зависимость степени насыщения фермента субстратом от концентрации субстрата при положительной (I) и отрицательной (II) кооперативности, а также в ее отсутствии (III).

Предстационарная кинетика. При быстром смешении р-ров фермента и субстрата в интервале времен 10 -6 -10 -1 с можно наблюдать переходные процессы, предшествующие образованию устойчивого стационарного состояния. В этом предстационарном режиме при использовании большого избытка субстрата система дифференц. ур-ний, описывающая кинетику процессов, линейна. Решение данного типа системы линейных дифференц. ур-ний дается суммой экспоненциальных членов. Так, для кинетич. схемы, представленной выше, кинетика накопления продукта имеет вид:

где A i -> , b, а n -> ф-ции элементарных констант скорости; -корни соответствующего характеристич. ур-ния.

Величина, обратная , наз. характеристич. временем процесса:

Для р-ции, протекающей с участием nпромежут. соед., можно получить nхарактеристич. времен.

Исследование кинетики ферментативной р-ции в предстационарном режиме позволяет получить представление о детальном механизме каталитич. цикла и определить константы скорости элементарных стадий процесса.

Экспериментально кинетику ферментативной р-ции в предстационарном режиме исследуют с помощью метода остановленной струи (см. Струевые кинетические методы), позволяющего смешивать компоненты р-ции в течение 1 мс.

Релаксационная кинетика. При быстром возмущающем воздействии на систему (изменение т-ры, давления, электрич. поля) время, к-рое необходимо системе для достижения нового равновесия или стационарного состояния, зависит от скорости процессов, определяющих каталитич. ферментативный цикл.

Система ур-ний, описывающая кинетику процесса, линейна, если смещение от положения равновесия невелико. Решение системы приводит к зависимостям концентраций компонентов разл. стадий процесса в виде суммы экспоненциальных членов, показатели экспонент к-рых имеют характер времен релаксаций. Результатом исследования является спектр времен релаксации, соответствующий числу промежут. соед., участвующих в процессе. Величины времен релаксаций зависят от констант скорости элементарных стадий процессов.

Релаксационные методы кинетики позволяют определить константы скорости отдельных элементарных стадий трансформации интермедиатов. Методы изучения релаксационной кинетики имеют разл. разрешающую способность: поглощение ультразвука - 10 -6 -10 -10 с, температурный скачок - 1O -4 -10 -6 с, метод электрич. импульса - 10 -4 -10 -6 с, скачок давления - 10 -2 с. При исследовании кинетики ферментативных р-ций наиб, применение нашел метод температурного скачка.

Макрокинетика ферментативных процессов. Развитие методов получения гетерогенных катализаторов путем иммобилизации ферментов на разл. носителях (см. Иммобилизованные ферменты )обусловило необходимость анализа кинетики процессов с учетом массопереноса субстрата. Теоретически и экспериментально исследованы закономерности кинетики р-ций с учетом эффектов диффузионного слоя и для систем с внутридиффузионными затруднениями при распределении фермента внутри носителя.

В условиях, когда на кинетику процесса влияет диффузионный перенос субстрата, каталитич. эффективность системы уменьшается. Фактор эффективности равен отношению плотности потока продукта в условиях протекания ферментативной р-ции с диффузионно пониженной концентрацией субстрата к потоку, к-рый мог бы реализоваться в отсутствие диффузионных ограничений. В чисто диффузионной области, когда скорость процесса определяется массопереносом субстрата, фактор эффективности для систем с внешнедиффузи-онным торможением обратно пропорционален диффузионному модулю :

где толщина диффузионного слоя, D - коэф. диффузии субстрата.

Для систем с внутридиффузионным торможением в р-циях первого порядка

где Ф т - безразмерный модуль (модуль Тиле).

При анализе кинетич. закономерностей в ферментативных реакторах широкое теоретич. и эксперим. развитие получили "идеальные" модели реакторов, проточный (проточный реактор идеального перемешивания), проточный реактор с идеальным вытеснением, мембранный реактор.

Кинетика полиферментных процессов. В организме (клетке) ферменты действуют не изолированно, а катализируют цепи трансформации молекул. Р-ции в полиферментных системах с кинетич. точки зрения можно рассматривать как последоват. процессы, специфич. особенностью к-рых является ферментами каждой из стадий:

где , соотв. макс, скорость процесса и константа Михаэлиса i -й стадии р-ции соответственно.

Важная особенность процесса - возможность образования устойчивого стационарного состояния. Условием-его возникновения может служить неравенство > v 0 , где v 0 - скорость лимитирующей стадии, характеризуемой наименьшей константой скорости и тем самым определяющей скорость всего последоват. процесса. В стационарном состоянии концентрации метаболитов после лимитирующей стадии меньше константы Михаэлиса соответствующего фермента.

Специфич. группу полиферментных систем составляют системы, осуществляющие окислит.-восстановит. р-ции с участием белковых переносчиков электронов. Переносчики образуют специфич. структуры, комплексы с детерминированной последовательностью переноса электрона. Кинетич. описание такого рода систем рассматривает в качестве независимой переменной состояния цепей с разл. степенью заселенности электронами.

Применение. Ф. р. к. широко используют в исследовательской практике для изучения механизмов действия ферментов и ферментных систем. Практически значимая область науки о ферментах - инженерная энзимология, оперирует понятиями Ф. р. к. для оптимизации биотехнол. процессов.

Лит.: Полторак О. M., Чухрай E. С, Физико-химические основы ферментативного катализа, M., 1971; Березин И. В., Мартинек К, Основы физической химии ферментативного катализа, M., 1977; Варфоломеев С. Д., Зайцев С. В., Кинетические методы в биохимических исследованиях, M.. 1982. С. Д. Варфоломеев.

Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .

Смотреть что такое "ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КИНЕТИКА" в других словарях:

Каталитич. р ция циклич. процесс, складывающийся из ряда элементарных р ций, скорости к рых описываются действующих масс законом. Этот закон имеет простую форму для идеальных газовых смесей, идеальных р ров и идеальных поверхностных слоев.… … Химическая энциклопедия

Кинетика химических реакций, учение о химических процессах о законах их протекания во времени, скоростях и механизмах. С исследованиями кинетики химических реакций связаны важнейшие направления современной химии и химической… … Большая советская энциклопедия

КИНЕТИКА ХИМИЧЕСКАЯ - (от греч. kinesis движение), отдел теоретической химии, посвященный изучению законов хим. реакций. Можно наметить несколько типов хим. взаимодействий и прежде всего отличать реакции, протекающие в гомогенной (однородной) среде, от реакций,… … Большая медицинская энциклопедия

- (биокатализ), ускорение биохим. р ций при участии белковых макромолекул, называемых ферментами (энзимами). Ф. к. разновидность катализа, хотя термин ферментация (брожение)известен с давних времен, когда еще не было понятия хим. катализа. Первое… … Химическая энциклопедия

- (от лат. re приставка, означающая обратное действие, и actio действие), превращения одних в в (исходных соед.) в другие (продукты р ции) при неизменяемости ядер атомов (в отличие от ядерных реакций). Исходные соединения в Р. х. иногда наз.… … Химическая энциклопедия

- (от лат. fermentum закваска) (энзимы), белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Осн. ф ции Ф. ускорять превращение в в, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его … Химическая энциклопедия

- (от греч. pharmakon лекарство и kinetikos приводящий в движение), изучает кинетич. закономерности процессов, происходящих с лек. ср вом в организме. Осн. фармакокинетич. процессы: всасывание, распределение, метаболизм и экскреция (выведение).… … Химическая энциклопедия

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Vфр определяется количеством вещества, которое превращается в единицу времени. V этих реакций зависит от влияния внешних факторов (температура, рН, воздействие природных и чужеродных соединений и т.д.).

Vфр является мерой каталитической активности и обозначается просто как активность ферментов.
Измерить активность ферментов можно только косвенно:
1) по количеству превращаемого S;
2) нарастанию концентрации Р в единицу времени.
Для выражения концентрации фермента пользуются:
а) единица измерения ферментов – это то количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля S в мин. [мкмоль/мин];
б) 1 катал (кат) – количество ферментов, способное вызывать превращение 1 моля S в Р в 1 сек. [моль/с].
1 кат = 6×107Е; 1Е = 16,67 (н кат)
Для выражения активности ферментов пользуются:
а) удельная активность ферментов – это число ферментов на 1 мг или число кат. на 1 кг белка;
б) молекулярная активность или число оборотов – это число молекул S, подвергающихся превращению одной молекулой Е в 1 мин.
Одна молекула каталазы эритроцитов расщепляет в 1 мин 5×106 молекул Н2О2.

Специфичность действия ферментов
Понятие Е S комплекса и АЦФ тесно взаимосвязаны с особым свойством ферментов – их специфичностью. По степени специфичности (в порядке ее снижения) различают:
I. Стереохимическую субстратную специфичность – в этом случае ферменты катализируют только 1 форму S (1 изомер). Например, фумаратгидратаза катализирует только превращение фумаровой кислоты, но не катализирует превращение ее изомера – малеиновую кислоту.
II. Абсолютную субстратную специфичность – Е превращает только 1S. Например, уреаза превращает только мочевину.
III. Абсолютная групповая S-ную специфичность. Ферменты действуют на группу сходных S-в. Например, алкоголь ДГ превращает не только этанол, но и другие алифатические спирты.
IV. Относительную групповую S-ную специфичность. Фермент воздействует не на группу молекул S, а на определенные связи определенных групп S-в. Например, пепсин и трипсин специфичны по отношению к пептидным связям в различных белках.
V. Относительную S-ную специфичность. Фермент катализирует, превращаясь в S-в, относящимся к различным группам химических соединений. Например, фермент цитохром-450 катализирует реакции гидроксилирования до 7000 разных S-в. Это наименее специфичная ферментная система.

Существует две теории объяснения специфичности ферментов.
Гипотеза Э. Фишера – гипотеза «ключа и замка» или гипотеза «шаблона». По Фишеру, фермент – это жесткая структура, АЦФ которого - точный «слепок» S-та. Если S подходит к Е как ключ к замку, то реакция произойдет. Если же S немного изменен («ключ»), то он не соответствует АЦФ («замку»), и реакция становится невозможной. Несмотря на логичность такого объяснения, гипотеза Фишера не объясняет, на чем тогда основаны абсолютная и относительная групповая специфичность. Например, цитохром-450 соединяется с таким большим количеством S-в, различных по строению.
Эти внешние противоречия объясняет гипотеза Кошленда, или гипотеза вынужденного соответствия. По мнению Кошленда, молекула фермента не «жесткая», а гибкая структура и конфигурация фермента и его АЦФ начинают изменяться в момент присоединения фермента к S или другим лигандам. При образовании Е-S комплекса кроме геометрической комплементарности имеет место и электростатическая, которая осуществляется благодаря спариванию противоположно заряженных молекул Е и S. В действительности, видимо, имеют место оба варианта присоединения.

Гипотеза Кошленда позволяет объяснить, почему происходит превращение близких аналогов S-в. Если «ложный» субстрат (квази-S) отличается от природного и АЦФ принимает конформацию близкую к истинному субстрату, то расстановка каталитических групп в таком Е-S комплексе позволит осуществить реакцию. Этот «обман» фермент как бы не замечает, хотя реакция идет и не так быстро, как с истинным субстратом. Если конфигурация квази субстрата не позволяет правильно расположиться каталитической группе, то в этом случае реакция не пойдет. Т.е. если диапазон конформационных перестроек ограничен до одной единственно возможной, то фермент высокоспецифичен, а если возможности перестройки АЦФ велики, то фермент срабатывает и на квази субстраты.

Зависимость Vфр от рН-среды
Для каждого фермента имеется свой оптимум рН, при котором Vфр максимальна. Отклонение рН в ту или другую сторону ведет к снижению активности фермента. Большая часть ферментов имеет рН~7,0 то есть он совпадает с физиологическими значениями рН.
При оптимальном значении рН функциональные группы АЦФ и сам S находятся в наиболее предпочтительной для связи форме. Некоторые ферменты имеют оптимальную рН, резко отличающиеся от физиологических значений, пепсин на 100% активен при рН = 1,5-2,5; аргиназа – при рН = 10.

Зависимость Vфр от температуры
С повышением температуры среды Vфр увеличивается, достигает оптимальных величин ~ 20-40ºС для большинства ферментов.
Термолабильность ферментов связана с их белковым строением: при повышении температуры до 40-50ºС и выше, происходит их денатурация.
Для некоторых ферментов денатурации наступает при 0ºС.
Для любых химических реакций при повышении температуры на каждые 10ºС V реакции увеличивается в 2-3 раза, для ферментативных реакций этот коэффициент ниже – 2 и даже меньше. Исключение: термостабильный фермент адениматциклаза выдерживает температуру 100ºС, а фермент каталаза активен при 0ºС.

Зависимость Vфр от конц. S.
Механизм действия ферментов описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Установить зависимость Vфр от [S] можно графически.
а) по кривой Михаэлиса: чем меньше Km, тем больше Vm и тем выше сродство E к S.
Vmax соответствует состоянию полного насыщения фермента S-том.

в растворе избыток Е (3 мол S, 5 мол Е) это участок насыщения фермента S-том.
б) методом обратных величин Лайнцивера-Берка, где зависимостьVфр от [S] рассчитывают в обратных величинах.

Регуляция активности ферментов.
Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью, поэтому через ферменты можно контролировать Vфр. Регуляция активности может осуществляться путем взаимодействия ферментов с различными биологическими компонентами или же чужеродными соединениями (лекарствами, ядами), которые называются модификаторами. Если в присутствии модификатора Vфр возрастает, то такие модификаторы называют активаторами, а если падает ингибиторами.

Активирование ферментов.
Существует несколько видов активации ферментов.
1. Активирование путем воздействия на субъединицы молекул фермента. Некоторые ферменты имеют ЧС в виде 2-х субъединиц: каталитической и регуляторной. При сохранении ЧС АЦФ скрыт.

Например, многие ферменты в организме вырабатываются в виде проферментов или зимогенов, то есть в неактивном состоянии. По мере необходимости определенное их количество активируется. Например, неактивный трипсиноген под действием фермента энтерокиназы превращается в активный трипсин.
2. На активирование ферментов влияют ионы:
а) катионы – их воздействие более специфично, чем анионов. Катионы могут сами выступать в виде простетических групп в ферментах (Fe в цитохроме) или своим присутствием воздействовать на фермент, активируя его. Например, угольная ангидраза активируется в присутствии Zn+2.
б) анионы – действуют менее специфично и обычно виляют на 2-й этап ф.р. – распад ES-комплекса. Однако иногда и анионы являются непосредственными активаторами ферментов. Например, Cl– активирует неактивный пепсиноген и превращает его в активный пепсин.
3. Активация путем защиты ферментов от инактивирующего влияния различных воздействий. Обеспечивается специфическими веществами, предупреждающими отрицательное влияние на ферменты.

Ингибирование ферментов.
Вещества, вызывающие частичное или полное торможение ферментов называются ингибиторами(I). Ингибиторы обладают свойством прочно связываться с ферментом. По этому признаку различают ингибирование: обратимое и необратимое.
При обратимом ингибировании I и Е вступают во взаимодействием. Если каким-нибудь образом ингибитор нейтрализовать (например, диализом), то активность Е восстанавливается. Если этого не удается достигнуть, то речь идет о необратимом ингибировании.
Обратимое ингибирование

конкурентное неконкурентное
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами со структурой, сходной со структурой истинного S.

I и S конкурируют за АЦФ, комплекс с ферментом образует то соединение, молекул которого больше. С ферментом связывается либо I, либо S, для такого ингибирования справедливо уравнение: .
НИКОГДА при конкурентном ингибировании не образуется тройной комплекс E S I, чем этот вид ингибирования отличается от других.
Например, сукцинат ДГ входит в состав ферм. системы ЦТК. Его природный S – сукцинат. Ингибиторами могут быть оксалоацетат, малонат (квази-субстраты).

При избытке ингибитор связывается поляризованными группами с АЦФ сукцинат ДГ.
При конкурентном ингибировании Vmax никогда не меняется, но меняется Km. Наклон кривых в присутствии I увеличивается, в результате Km увеличивается

По результатам эксперимента по кривой Михаэлиса-Ментен можно установить конкурентную природу I (по увеличению Km и стабильности Vmax). Характер этой кривой свидетельствует и об обратимости процесса, то есть увеличивая [S], можно сократить время достижения Vmax.
Метод конкурентного ингибирования нашел широкое применение в медицинской практике.

Пара-аминобензойная кислота и сульфаниламид имеют сходную структуру. п-АБК-ту бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составляющей частью ферментов бактерий. С/а блокирует действие ферментов, синтезирующих фолиевую кислоту, в результате рост бактерий останавливается.

Неконкурентное ингибирование – это обратимое торможение, когда I взаимодействует не с АЦФ, а с другими функциональными группами ферментов, то есть в данном случае I не имеет структурного сходства с S. Присоединение такого ингибитора снижает активность фермента, а не его сродство к S, то есть ингибитор не изменяет Km, а снижает макс. Vфр.

При этом виде ингибирования образуется неактивные малодиссоциирующие комплексы E I или E I S. Например, действие HCN, других химических соединений, связывающих ионы Ме или других функциональных групп в молекуле фермента.

Смешанное ингибирование (или частично неконкурентный тип) - снижение Vmax сочетается с увеличением Km.

При этом образуется Е I S-комплекс, а S в нем подвергается медленному каталитическому превращению.

Субстратное ингибирование – это снижение Vфр при значительном повышении [S]. Первоначально, с увеличением [S] Vфр растет, достигая своего максимума, но при дальнейшем увеличении [S] Vфр начинает падать.
Механизм ингибирующего действия избытка S разнообразен. Чаще всего это взаимодействие промежуточных соединений E S с еще одной иди несколькими молекулами S, в результате чего образуется неактивное соединение, то
есть комплекс, не дающий продуктов реакции.

Методы регуляции активности ферментов
В живом организме одновременно происходят реакции синтеза, распада и взаимопревращений тысяч разнообразных веществ. Все эти множества реакций регулируются в организме посредством различных механизмов, наиболее важными из которых являются:
а) регуляция по типу обратной связи; характерна обычно для реакций синтеза. Накопление продуктов реакции свыше допустимого уровня оказывает сильное ингибирующее действие на первую стадию процесса:

б) аллостерическая регуляция активности ферментов – характерна только для особой группы ферментов с ЧС, имеющих регуляторные центры для связывания аллостерических эффекторов. Отрицательные эффекторы тормозят превращение S и выступают в роли аллостерических ингибиторов. Положительные эффекторы, напротив, ускоряют Vфр, поэтому их относят к к аллостерическим активаторам.

Механизм действия аллостерических ингибиторов на фермент заключается в изменении АЦФ этого фермента. Уменьшение Vфр является либо следствием увеличения Km, либо результатом уменьшенияVmax, при тех же насыщающих концентрациях S. Аллостерические активаторы напротив облегчают превращение S в АЦФ, что сопровождается либо уменьшением Km, либо увеличением Vmax.

Компартментализация – явление, при котором с помощью мембран пространственно разъединяется
а) фермент от своих S (например, лизомальные ферменты от веществ, на которые они действуют в цитоплазме);
б) взаимно несовместимые в одно и тоже время процессы. Синтез жк происходит в растворимой части цитоплазмы, а распад жк – в митохондриях.

Ферментативная кинетика изучает скорость реакций, катализируемых ферментами в зависимости от различных условий (концентрации, температуры, pH и др.) их взаимодействия с субстратом.

Однако ферменты - это белки, чувствительные к влиянию различных внешних воздействий. Поэтому при изучении скорости ферментативных реакций учитывают, главным образом, концентрации реагирующих веществ, а влияние температуры, pH среды, активаторов, ингибиторов и прочих факторов стараются свести к минимуму и создают стандартные условия. Во-первых, это оптимальное для данного фермента значение pH среды. Во-вторых, рекомендуется придерживаться температуры 25°С, в тех случаях, где это возможно. В-третьих, достигают полного насыщения фермента субстратом. Этот момент особенно важен, поскольку при низкой концентрации субстрата не все молекулы фермента участуют в реакции (рис. 6.5, а ), значит и результат будет далек от максимально возможного. Наибольшая мощность катализируемой реакции, при прочих равных условиях, достигается, если каждая молекула фермента участвует в превращении, т.е. при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса (рис. 6.5, в). Если же концентрация субстрата не обеспечивает полного насыщения фермента (рис. 6.5, б ), то скорость протекающей реакции не достигает максимального значения.

Рис. 65.

а - при низкой концентрации субстрата; 6 - при недостаточной концентрации субстрата; в - при полном насыщении фермента субстратом

Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении перечисленных условий, и полном насыщении фермента субстратом называют максимальной скоростью ферментативной реакции (V).

Скорость ферментативной реакции, определяемая при неполном насыщении фермента субстратом, обозначается v.

Ферментативный катализ упрощенно можно описать схемой

где F - фермент; S - субстрат; FS - фермент-субстратный комплекс.

Каждая стадия этого процесса характеризуется определенной скоростью. Единицей измерения скорости ферментативной реакции служит количество молей субстрата, превращаемое в единицу времени (как и скорость обычной реакции).

Взаимодействие фермента с субстратом приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, но этот процесс обратимый. Скорости прямой и обратной реакций зависят от концентраций реагирующих веществ и описываются соответствующими уравнениями:

В состоянии равновесия справедливо уравнение (6.3), поскольку скорости прямой и обратной реакции равны.

Подставив значения скорости прямой (6.1) и обратной (6.2) реакции в уравнение (6.3), получим равенство:

Состояние равновесия характеризуется соответствующей константой равновесия К р, равной отношению констант прямой и обратной реакций (6.5). Величина, обратная константе равновесия, называется субстратной константой K s , или константой диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Из уравнения (6.6) ясно, что субстратная константа уменьшается при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса, т.е. при большой его устойчивости. Следовательно, субстратная константа характеризует сродство фермента и субстрата и соотношение констант скоростей образования и диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Явление насыщения фермента субстратом изучали Леонор Михаэлис и Мод Мептен. На основе математической обработки результатов ими было выведено уравнение (6.7), получившее их имена, из которого ясно, что при высокой концентрации субстрата и низком значении субстратной константы скорость ферментативной реакции стремится к максимальной. Однако это уравнение носит ограниченный характер, поскольку учитывает не все параметры:

Фермент-субстратный комплекс в процессе реакции может подвергаться превращениям в разных направлениях:

• диссоциировать на исходные вещества;
• превращаться в продукт, от которого отделяется фермент в неизменном виде.

Поэтому для описания суммарного действия ферментативного процесса введено понятие константы Михаэлиса К т, которая выражает взаимосвязь констант скоростей всех трех реакций ферментативного катализа (6.8). Если оба слагаемых разделить на константу скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса, то получится выражение (6.9):

Из уравнения (6.9) вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше субстратной константы на величину k 2 /k v

Численно К т равна такой концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимально возможной скорости и соответствует такому насыщению фермента субстратом, как на рис. 6.5, б. Поскольку на практике не всегда удается достичь полного насыщения фермента субстратом, то именно К т используется для сравнительной характеристики кинетических характеристик ферментов.

Скорость ферментативной реакции при неполном насыщении фермента субстратом (6.10) зависит от концентрации фермент-субстратного комплекса. Коэффициентом пропорциональности служит константа реакции освобождения фермента и продукта, поскольку при этом меняется концентрация фермент-субстратного комплекса:

После преобразований, с учетом представленных выше зависимостей, скорость ферментативной реакции при неполном насыщении фермента субстратом описывается уравнением (6.11), т.е. зависит от концентраций фермента, субстрата и их сродства K s:

Графическая зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата не является линейной. Как очевидно из рис. 6.6, с увеличением концентрации субстрата наблюдается рост активности фермента. Однако при достижении максимального насыщения фермента субстратом скорость ферментативной реакции становится максимальной. Следовательно, фактором, ограничивающим скорость реакции, является образование фермент-субстратного комплекса.

Практика показала, что концентрации субстратов, как правило, выражаются значениями намного меньше единицы (10 6 -10 3 моль). Оперировать такими величинами в расчетах довольно сложно. Поэтому Г. Лайнуивер и Д. Берк предложили выражать графическую зависимость скорости ферментативной реакции не в прямых координатах, а в обратных. Они исходили из предположения, что для равных величин равны и обратные им значения:

Рис. 6.6.

После преобразования выражения (6.13) получается выражение, называемое уравнением Лайнуивера - Бэрка (6.14):

Графическая зависимость уравнения Лайнуивера- Берка носит линейный характер (рис. 6.7). Кинетические характеристики фермента определяются следующим образом:

• отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/V;
• отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, равен -1 /К т.

Рис. 6.7.

Считается, что метод Лайнуивера - Берка позволяет более точно, чем в прямых координатах, определить максимальную скорость реакции. Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования фермента.

Существуют и другие способы преобразования уравнения Михаэлиса- Ментен. Графические зависимости используют при изучении влияния различных внешних воздействий на ферментативный процесс.

Кинетика ферментативных реакций. Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса - Ментен :

где V - стационарная скорость биохимической реакции; Vmax - максимальная скорость; Кm - константа Михаэлиса; [S] - концен­трация субстрата.

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S] << Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Тогда

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f[S] (рисунок б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> Кm, когда Кm можно пренебречь, уравнение Михаэлиса - Ментен приобретает вид, т.е. V=Vmax.

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

где S - субстрат; Е - фермент; ES - фермент-субстратный комп­лекс; Р - продукт; k1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k2 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k3 - константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса . При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции. Vmах - это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса .

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной. Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. Кm имеет малые значения, когда k1 > (k2 + k3), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения Кm, тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если Кm имеет большое значение, то (k2 + k3) > k1 и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов . Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы - это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы - это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на:

• спе­цифические,
• неспецифические.

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов - это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие , но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов . Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием, или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз - отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации - диссоциации субъединиц , входящих в их со­став.

Многие ферменты могут находиться в двух формах: в виде про­стого белка и в виде фосфопротеида. Переход из одной формы в дру­гую сопровождается изменением каталитической активности.

Скорость ферментативной реакции зависит от количества фермента , которое в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Этот способ регуляции скорости ферментативной реакции является более медленным процессом, чем регуляция активности фер­мента.